近岸類器官課堂-腸來腸往

近岸類器官課堂-“腸來腸往”

Novoprotein  2022-05-20 15:06 發表於浙江

腸上皮是成年哺乳動物自我更新最快的組織，平均自我更新時間少於5天。腸幹細胞位於腸隱窩（intestinal crypt）底部附近，每個隱窩中的幹細胞大約有4-6個，它們產生快速增殖的轉運擴增(TA)細胞，腸細胞、杯狀細胞和腸內分泌細胞都從TA細胞發育而來。TA細胞快速分裂、轉運擴增的子細胞佔據了隱窩的其餘部分，並流向絨毛的側面，在那裡它們分化、吸收營養，最終在絨毛尖端凋亡^【1 】。
在體外可以由hPSCs來模擬胚胎腸發育的過程，透過添加高濃度的FGF4和Wnt3A，促使hPSCs衍生的終內胚層(DE)向中腸和後腸內胚層分化，並促進腸管樣形態發生，進而產生包含吸收性腸細胞以及主要分泌譜系(包括Paneth細胞、杯狀細胞和腸內分泌細胞)的腸道類器官。本篇文章基於Nature protocols ^【2】整理了hPSCs細胞來源的腸類器官培養方案。
細胞來源 
hPSCs
培養基配方

hPSCs培養與繼代
1.將凍存的Matrigel在4°C下過夜解凍，在6孔板的每孔滴加1ml冷的Matrigel，旋動6孔板使Matrigel溶液分佈均勻。接著轉移至37℃條件下培養10min使其凝固，使用前需室溫靜置1h。
2.將hPSCs接種在包被Matrigel的6孔板中，每孔加入3ml mTeSR1，放置在37℃，5%CO ₂的培養箱中，培養至細胞融合度約75–85%、且大部分無分化的狀態時，吸出培養基。
3.在hPSCs中加入1 ml Dispase（1mg/ml），並將培養皿放置在37℃條件下進行解離，直到所有的細胞都以小細胞塊或單細胞的形式漂浮。在每個孔中加入5ml的DMEM-F12，以充分稀釋Dispase。
4.將所有細胞轉移至離心管中，室溫下300g離心3min，收集沉澱細胞。加入DMEM-F12培養基，以1:6的比例接種在Matrigel包被的24孔培養板中，向每個孔中加入0.5ml預熱的mTeSR1進行培養，在2-4天內細胞匯合度達到85 -90%。
hPSCs分化成DE
5.吸出mTeSR1，在每個孔中加入0.5 ml預熱的第1天內胚層分化培養基，並將平板放回37℃，5%CO ₂的培養箱中。
6.24h後，吸出第1天內胚層分化培養基，換成每孔0.5ml預熱的第2天內胚層分化培養基，並將平板放回37℃，5%CO 2的培養箱_中。
7.24h後，吸出第2天內胚層分化培養基，換成每孔0.5ml預熱的第3天內胚層分化培養基，並將平板放回37℃，5%CO 2的培養箱_中。
8.24h後，吸出第3天內胚層分化培養基，以不含Activin A的第3天內胚層分化培養基洗滌細胞一次。此時在顯微鏡下觀察細胞，應該存在扁平的DE組織，該組織包含非常少的3D結構。
DE分化為中腸和後腸
9.從24孔板中吸出培養基，每孔滴加0.5 ml預熱的中腸和後腸分化培養基。每24h更換一次新鮮中腸和後腸分化培養基，直至96h 。
10.在立體顯微鏡下，可以看到明顯的3D結構。使用200μl移液管吸頭從每個孔中收集球狀體，並將大約50個球狀體集中到1.5ml微量離心管中。
中腸和後腸球狀體生長成人腸類器官
11.收集球狀體後，將微量離心管垂直放置在管架上10min，此時球體經由重力沉澱到離心管底部。吸出上清，控制總體積約25μl。
12.將冷凍的Matrigel在4℃下過夜解凍，添加B-27補充劑(終濃度1×)、R-spondin1(終濃度500ng/ml)，Noggin(終濃度100ng/ml)和EGF(終濃度100ng /ml)，用移液管吹打混勻，配製成腸基質膠。
13.將球狀體滴加在預冷的腸基質膠中，並將樣本混勻，總體積將達到75μl(50μl基質膠+ 25μl培養基+球狀體)。
14.將混合物接種在4孔板中，注意需接種在孔的中心，避免接觸側壁。
15.將4孔板放入37℃，5% CO ₂的培養箱中孵育10min，使Matrigel固化。
16.在每個孔中緩慢滴加0.5ml腸道生長培養基，確保基質膠被完全覆蓋。
17.每隔4天，或當培養基中的酚紅變黃時，更換腸生長培養基。
腸類器官繼代
18.在第14天左右，透過將腸類器官重新包埋在新鮮的Matrigel中，來實現繼代。
19.在顯微鏡下觀察類器官，吸出孔內的培養基，加入少量DMEM-F12培養基。
20.使用200μl移液管吸頭用力上下吹打Matrigel 3-5次，釋放Matrigel中的類器官。
21.在37℃，5% CO ₂的培養箱中培養組織14天，每4天更換一次腸道生長培養基。

圖1. 人腸類器官的培養過程^【2】

腸類器官的最新應用進展
腸道類器官可以在體內移植，作為再生醫學的臨床前工具。2022年2月日本學​​者Satoshi Watanabe等人^【3】利用右旋糖酐硫酸鈉給藥，在結腸遠端引發上皮損傷，隨後將腸道類器官原位移植到受體小鼠的結腸中，實現了上皮細胞的重建。此步驟可在10分鐘內完成，為腸類器官治療潰瘍性結腸炎的臨床試驗奠定了基礎。

圖2. 腸類器官（綠色）在移植1週後，成功整合到小鼠上皮損傷的區域^【3】