近岸類器官課堂-心靈捕手
Novoprotein 2022-06-10 19:40 發表於浙江
心臟是哺乳動物最早形成的器官之一，這使得它極易受到內在和外在疾病因素的影響。心肌細胞的分化受轉錄途徑的調節，產生不同的心肌細胞群，例如竇房結細胞、房室細胞、心房細胞、心室細胞和浦肯野細胞。每個群體都與特定的心臟疾病相關，因此可以透過類器官對相關疾病進行建模。3D培養心臟類器官（human cardiac organoids，hCOs）由於具有更複雜的結構和更多樣化的細胞類型，正在逐步成為更適用於研究心臟發育、物測試的體外模型。
本篇文章基於Nature Biotechnology 【1】，Stem cells and development 【2】、Development 【3】、Current Protocols in Stem Cell Biology 【4】發表的四篇文章，整理了人類胚胎幹細胞（human ESCs）來源的心臟類器官培養方案。
圖1. hESCs來源的hCOs培養方案【1】
細胞來源
Human ESCs
培養基配方
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ESCs培養和繼代
1.將100mm培養皿包覆5ml 0.1%（w/v）的明膠，室溫靜置15min至明膠凝固。
2.在明膠上接種絲裂黴素處理過的MEFs細胞懸浮液，細胞數約為1.8×10 6個。放置在37℃，5%CO 2的培養箱中培養至細胞匯合度70-80%時進行繼代。
3.吸去MEFs培養基，將ESCs接種於明膠上，加入10ml ESCs培養基，放置在37℃，5%CO 2的培養箱中培養3-5天。
4.在hESCs中加入1ml TrypLE Express，並將培養皿放置在37℃條件下進行解離，直到所有的細胞都以小細胞塊或單細胞的形式漂浮。
5.將所有細胞轉移至離心管中，室溫下300g離心3min，收集沉澱細胞。加入DMEM-F12培養基，以1:6的比例接種在Matrigel包被的24孔培養板中，向每個孔中加入0.5ml預熱的mTeSR1進行培養，在2-4天內細胞匯合度達到85 -90%。
6.以中胚層培養基進行換液，放置在37℃，5%CO 2的培養箱中培養3天，每天換液一次。
7. 以心肌分化培養基（I）進行換液，放置在37℃，5%CO 2的培養箱中培養3天，每天換液一次。
8. 以心肌分化培養基（II）進行換液，放置在37℃，5%CO 2的培養箱中培養7天，每天換液一次。
9. 以心肌分化培養基（III）進行換液，放置在37℃，5%CO 2的培養箱中培養2天，每天換液一次。
10. 分化後，吸出原培養基，加入含 0.2% I型膠原蛋白酶和20% FBS 的PBS溶液（含Ca 2+和Mg 2+），消化60min後，加入0.25% Trypsin-EDTA再消化10min。
11.加入MEM完全培養基（10%FBS，1% penicillin-streptomycin，200mM L-ascorbic）終止消化，將所得細胞以100μm孔徑濾膜過濾。
hCOs培養
12. 將細胞以hCOs形成培養基（I）重懸並進行細胞計數，依照5,000個/孔的密度接種於低吸附96孔板中。4℃條件下300g離心3 min後，放置於37℃，5%CO 2的培養箱中過夜培養。
13. 用Matrigel將每孔細胞進行包埋，放置於37℃培養箱中使Matrigel固化。加入hCOs形成培養基（II）至完全淹過Matrigel，放置在37℃，5%CO 2的培養箱中培養1天。
14.之後以hCOs形成培養基（I）進行換液，放置在37℃，5%CO 2的培養箱中培養1天。
15.以hCOs形成培養基（III）進行換液，放置在37℃，5%CO 2的培養箱中培養2天后，將培養基換成hCOs形成培養基（I），放置在37℃，5 %CO 2的培養箱中培養1天。
16.最後用hCOs形成培養基（IV）進行換液，放置在37℃，5%CO 2的培養箱中培養4-6天。
hCOs的應用與展望
hCOs是一種類似體內器官的三維細胞結構，在很大程度上，hCOs比以前的模型更準確地保留了體內的生物學特徵和功能。隨著生物技術的不斷發展，hCOs模型變得越來越複雜和成熟，大大推進了心臟生理學領域的研究。
Tiburcy et al. 【5】成功建構了具有心肌結構和功能特徵的hCOs，透過神經體液過度刺激來模擬人類心臟衰竭情況。並且在體外使用hCOs進行了藥物測試，為今後針對心臟衰竭開發新的治療手段和藥物提供了思路。
根據現有的報告，hCOs具有產生自發和誘發動作電位的能力，並且具有比二維模型更高的傳導速度，因此hCOs可用於研究致心律失常綜合徵中復雜的電生理現象。Shinnawi et al. 【6】使用hiPSC衍生的HCOs作為模型來評估抗心律不整候選藥物的療效。結果表明，應用奎尼丁和丙吡胺可延長動作電位持續時間，有效地緩解了心律不整。
目前hCOs仍然是相對簡化的器官樣組織，最重要的問題之一是缺乏豐富的血管網絡等更複雜的結構。圖2中的四種培養方法更好地模擬了多種細胞類型和亞區域之間的相互作用，這將有助於未來建構包含心室樣和心房樣結構和功能的hCOs。
圖2. 自組裝hCOs形成示意圖【7】
類器官作為一種研究模型，在發育生物學、疾病病理學、細胞生物學、再生機制、精準醫療以及藥物毒性和藥效試驗等方面潛力巨大。但是，類器官培養技術建立過程中會面臨多種挑戰。為了更輕鬆更有效率的建立類器官培養技術，歡迎各位掃碼加入類器官培養交流群，在這裡會有專業的技術支援人員幫您解惑答疑，也將定期分享類器官前沿進展，讓類器官培養更簡單！
參考文獻
【1】Drakhlis, L. et al. (2021). Human heart-forming organoids recapitulate early heart and foregut development. Nature Biotechnology , 39(6), 737-746.
【2】Hudson, J. et al. (2012). Primitive cardiac cells from human embryonic stem cells. Stem cells and development , 21(9), 1513-1523.
【3】Voges, HK et al. (2017). Development of a human cardiac organoid injury model reveals innate regenerative potential. Development , 144(6), 1118-1127.
【4】Costa, M. et al. (2008). Expansion of Human Embryonic Stem Cells In Vitro. Current Protocols in Stem Cell Biology , 5(1), 1C-1.
【5】Tiburcy, M. et al. (2017). Defined engineered human myocardium with advanced maturation for applications in heart failure modeling and repair. Circulation , 135(19), 1832-1847.
【6】Shinnawi, R. et al. (2019). Modeling reentry in the short QT syndrome with human-induced pluripotent stem cell–derived cardiac cell sheets. Journal of the American College of Cardiology , 73(18), 23100 .
【7】Zhao, D. et al. (2021). Cardiac organoid—A promising perspective of preclinical model. Stem Cell Research & Therapy , 12(1), 1-10.
| 貨號 | 產品名稱 |
| C076 | Human/Mouse/Rat BDNF |
| C012 | Human/Mouse/Rat BMP-2 |
| C688 | Human DKK1 (N-8His) |
| C029 | Human EGF |
| CH28 | Mouse EGF (C-6His) |
| CR08 | Human FGF-4 |
| CR66 | Mouse FGF-4 |
| CH73 | Human FGF-7/KGF |
| C198 | Human FGF-9 |
| CR12 | Mouse FGF-9 (N-6His) |
| CR11 | Human FGF-10 |
| CG74 | Human FGF-19 (N-6His) |
| C226 | Human GDNF |
| CJ72 | Human HGF (C-6His) |
| CC13 | Mouse HGF (C-6His) |
| C017 | Human LIF |
| C690 | Mouse LIF |
| CB89 | Human Noggin |
| C017 | Human LIF |
| C690 | Mouse LIF |
| C079 | Human NT-3 |
| C099 | Human OSM (N-6His) |
| C736 | Human Prolactin/PRL |
| CX83 | Human R-Spondin 1 (C-6His) |
| CB79 | Human R-spondin 3 (C-Fc-6His) |
| C100 | Human Shh |
| C089 | Human Shh (C24II) |
| CH69 | Mouse Shh |
| CH66 | Mouse Shh(C25II) |
| C06D | Human Wnt3a |
| C18K | Human Wnt3a V2 |