類器官培養100問-上篇50問(2)
Novoprotein 2023-06-15 18:42 發表於上海
類器官是能夠在體外三維培養，並表現出相應器官生物學特徵的“最小系統”。雖然對於類器官的研究日趨成熟，但大家總會有這樣那樣的小困惑：為什麼要用上皮細胞培養？為什麼培養基的成分這麼複雜？
Novoprotein憑藉構建類器官平臺的實踐經驗和深厚的文獻積累，圍繞類器官培養基本操作（基礎篇），腫瘤類器官培養（PDO篇），以及類器官應用等多個主題方向，精心整理了類器官培養常見問題100問，今天為大家帶來上篇。
<< 實際操作篇 >>
類器官是能夠在體外三維培養，並表現出相應器官生物學特徵的“最小系統”。雖然許多類器官的培養方案日漸成熟，但在實際操作中總會碰到這樣那樣的問題，今天小編整理了一些類器官培養操作中常遇到的問題，希望能夠對各位小夥伴有所幫助。
Q41: 按照文獻方法進行類器官培養，為什麼觀察到的形態卻和文獻不一致？
A41:決定類器官形態的因素有很多，樣本來源是否相同、選用的細胞因數品質是否有差異都有可能改變最終的類器官形態。這裡舉一個文獻中的例子，分別取四個高級別漿液性（HGS）卵巢癌患者的腫瘤組織，用同樣的條件進行類器官培養，H&E染色結果顯示它們的形態千差萬別【20】。因此對於類器官的鑒定，我們不能局限於形態觀察，需要使用多種方法相結合。
由4例HGS卵巢癌患者的腫瘤組織所製備的類器官形態不同【20】
Q42：類器官的藥敏實驗中需要使用DMSO作為藥物的溶劑，需要控制DMSO的用量嗎？
A42：考慮到DMSO這類有機物的細胞毒性，建議終濃度不超過0.1%（v/v）。
Q43：培養過程中發現類器官培養物中有黑色小顆粒，這個是雜質嗎？應該怎樣去除？
A43：黑色小顆粒大概率是雜質或細胞碎片，去除它們有以下兩種方式可以參考：
1、將類器官消化下來，用培養基進行反復清洗，達到稀釋雜質的作用；
2、用無菌手術刀將類器官切成兩半，取1ml注射器吸滿培養基並輕輕推出，沖洗類器官中的雜質【21】。
Q44：對於腫瘤患者的個性化醫療測試，PDO、PDX、PDXO的模型可以相互結合使用嗎？
A44：PDO、PDX、PDXO模型有各自的優勢，通常有以下兩種結合方式：PDO-PDX和PDX-PDXO。
1、PDO-PDX是性價比更高的方式，即：先利用PDO進行高通量的藥物篩選，篩選出有效的藥物再進行PDX測試。
2、PDX-PDXO是更精准的藥物測試方式，即：先利用PDX產生大量的體內腫瘤，然後將這些腫瘤分離進行PDXO培養，此時可以通過PDX模型，將PDXO的藥敏實驗結果與體內用藥結果一一對應，進而預測人體用藥的結果，實現對患者更精准的用藥指導；並且可以用PDX模型將轉移後的腫瘤分離，同樣進行PDXO培養和用藥，能夠更精確地對轉移灶進行藥物篩選。
Q45：類器官怎麼從基質膠中回收？
A45：1、將類器官放置在冰上，待基質膠融化後離心進行回收，這種方式適用於不需要將類器官結構完全打散的情況；
2、市售的細胞回收液，可以溫和有效地獲得細胞懸液，不會損傷細胞或細胞表面蛋白。
Q46：為什麼用基質膠來培養類器官？可以用其它類型的凝膠替代嗎？
A46：基質膠能夠為類器官提供支撐作用，目前類器官培養用的基質膠來源於小鼠肉瘤的基底膜基質，其中含有約60%層粘連蛋白、30% IV 膠原和8%的巢蛋白，還含有基底膜聚糖、TGF-ß、表皮生長因數、類胰島素生長因數、組織纖溶酶原等1800多種獨特的蛋白質。由於基質膠中各因數的不確定性，並且存在批次間差異，因此目前也有一些聚焦於基質膠替代方案的研究，見下圖【22】。
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基質膠的三種替代方案【22】。（a）去細胞外基質和其他衍生蛋白質，（b）合成水凝膠，以及（c）工程重組蛋白凝膠
Q47：怎樣確定某一種類器官的培養方式更適用於基質膠包埋法還是氣-液交互法呢？
A47：1、根據所類比的器官自身生長情況選擇，例如：皮膚的正常生長是有一面需要接觸空氣，那麼對於皮膚類器官的培養傾向于利用氣-液交互法來培養【23】；2、考慮所培養的類器官模型的應用方向，例如：氣-液交互法培養易於進行病毒感染實驗，因此用於病毒感染實驗的氣道類器官會優先選擇氣-液交互法培養【24】。
Q48：在進行藥敏實驗前，類器官的接種方式是怎樣的呢？
A48：藥物篩選前，通常將類器官吹散後，用含2%-5%基質膠的培養基懸浮，並最終鋪在基質膠包被的孔板中【25-26】。
Q49：在離心回收時，會有很多類器官粘附在離心管壁，有沒有更好的辦法提高回收率？
A49：建議採用水準轉子代替角轉子，可以有效減少類器官掛在離心管壁的情況。
Q50：利用腫瘤類器官模型進行篩選的藥物有什麼局限性嗎？
A50：1、抗體藥物因為需要免疫細胞的參與，因此腫瘤類器官不能篩選抗體類藥物，此類藥物篩選需要構建腫瘤類器官-腫瘤微環境的模型來實現；2、由於腫瘤類器官中沒有對血管進行培養，因此抗血管類的藥物也同樣不能進行篩選。
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